Amplificação do genoma de circovírus suíno tipo 2 (PCV2) por círculo rolante e produção de um clone viral

Resumo

O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) é o principal agente envolvido na Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS). Na maioria dos países onde a suinocultura tem expressiva importância econômica, a SMDS vem causando sérios prejuízos. Com o objetivo de contribuir para a caracterização genética de isolados brasileiros de PCV2, duas amostras autóctones foram clonadas e seqüenciadas na íntegra. Para tanto, o genoma viral foi extraído de tecidos de animais com SMDS e amplificado pelo método denominado “amplificação em círculo rolante com múltiplos primers” (ACRMP). Ambas seqüências apresentaram 1.767 nucleotídeos e diferiram entre si em apenas um nucleotídeo. A análise filogenética destas duas seqüências mostrou maior identidade com o grupo (1A) formado por isolados holandeses, franceses e chineses. Um  isolado brasileiro previamente sequenciado, de Minas Gerais, foi classificado em outro grupo e a seqüência diferiu em até 16 nucleotídeos em relação aos isolados do Rio Grande do Sul. Na etapa seguinte desses estudos, visando o futuro desenvolvimento de vacinas, um dos genomas aqui seqüenciados foi transfectado em células de testículo de suíno (ST). Antígenos virais nas células transfectadas foram detectados por imunoperoxidase, demonstrando assim a infecciosidade do clone produzido. Entretanto, o clone infeccioso obtido não foi capaz de multiplicar-se a ponto de fornecer massa antigênica que viabilizasse a produção de uma vacina. Em vista disso, realizou-se uma tentativa de criar uma linhagem celular persistentemente infectada. Para isso, o DNA de PCV2 foi novamente transfectado em células ST com um plasmídeo contendo o gene de resistência a geneticin, visando a seleção de colônias celulares resistentes. Após a transfecção, porém, observou-se um efeito negativo na formação de colônias resistentes a esta droga. Este efeito foi dose-dependente em relação à quantidade de DNA de PCV2, o que impossibilitou o estabelecimento de uma linhagem celular persistentemente infectada. Isto pode estar relacionado com a expressão da proteína da ORF3 que induz apoptose ou à indução de citocinas, como interferons, embora outros mecanismos não possam ser excluídos, como efeito tóxico do alto número de cópias de genomas de PCV2. Analisando os resultados obtidos durante a realização destes estudos, conclui-se que as amostras de PCV2 circulantes no Brasil apresentam de identidade alta (99,09 %).