Construção de vetor oriC de Mycoplasma hyopneumoniae – uma ferramenta para estudos genéticos do agente da pneumonia enzoótica suína

Resumo

Mycoplasma hyopneumoniae

é o agente etiológico da pneumonia enzoótica, enfermidade distribuída mundialmente em rebanhos suínos nas fases de crescimento e terminação. A pneumonia enzoótica tem sido considerada uma das mais importantes causas de perdas econômicas na suinocultura mundial. Tendo em vista a disponibilidade dos genomas completos de três linhagens diferentes de M. pneumoniae, sendo duas patogênicas (linhagens 7448 e 232) e outra não patogênica (linhagem J) e a ausência de sistemas genéticos adequados para o estudo destes genomas, é necessidade emergente o desenvolvimento de ferramentas genéticas funcionais neste organismo. Atualmente, cinco espécies de micoplasmas possuem vetores replicativos disponíveis para transformação. No entanto nenhum deles possui a oriC de M. hyopneumoniae, e estudos sugerem que estes vetores são espécie-específicos e não seriam replicados em M. hyopneumoniae. Este trabalho teve como objetivos a construção de um vetor replicativo e o desenvolvimento de um sistema para transformação de M. hyopneumoniae. Os resultados alcançados constituem uma etapa prévia e imprescindível para o estudo de supostas regiões promotoras nesta espécie. O plasmídio replicativo pOSTM construído neste trabalho foi obtido a partir do vetor pUC18, adicionando-se a origem de replicação de M. hyopneumoniae e o cassete de expressão do gene de resistência à tetraciclina (tetM), controlado pelo promotor do gene da espiralina de Spiroplasma citri. A transformação foi realizada através de eletroporação e as células transformantes foram selecionadas pelo fenótipo de resistência à tetraciclina. Os transformantes resistentes à tetraciclina foram confirmados através da amplificação por PCR de porção do vetor inserido nas células. Tal comprovação permite concluir que o M. hyopneumoniae é um organismo susceptível à transformação e que o determinante tetM heterólogo é funcional neste patógeno.