Otimização do sistema de produção de clones por transferência nuclear com a itilização de oócitos vitrificados e diferentes tipos celulares como doadores de núcleo - Forell, Fabiana (Acta Scientiae Veterinariae, 2018)
A técnica de transferência nuclear é uma ferramenta que possibilita a produção de embriões clones que podem ser utilizados tanto na clonagem reprodutiva, proporcionando o nascimento de produtos, como modelo para o estudo de diversos mecanismos fisiológicos durante o desenvolvimento embrionário. Este trabalho teve como objetivos a otimização da técnica de clonagem no Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução (FAVET, UFRGS), avaliar a taxa de sucesso da clonagem interespécie, e testar a eficiência da utilização de oócitos vitrificados como citoplasmas receptores para a reconstrução dos embriões clones, sendo realizado em três etapas. A primeira teve por objetivo o estabelecimento da técnica de clonagem, bem como sua otimização nas nossas condições, dando condições para que os experimentos subseqüentes pudessem ser realizados. Para isto, foram realizados experimentos in vitro comparando diferentes meios de manipulação, sistemas de ativação química, meios de cultivo e fontes protéicas no cultivo dos embriões, e células oriundas de diferentes origens e animais como doadores de núcleo. Os resultados obtidos in vitro alcançaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embriões foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos. A segunda parte dos experimentos teve por objetivo a produção de clones interespécies utilizando o citoplasma bovino como receptor para células ovinas, caprinas e suínas. As taxas de clivagem nos grupos NTSCi ovino (60,3%), caprino (68,4%) e suína (57,1%) não diferiram dos grupos controles NTSC bovino. A taxa de blastocisto observada nos embriões NTSCi ovinos (10,3%) foram semelhantes às taxas observadas no grupo NTSC bovino (12,7%). No grupo NTSCi caprino, 5,3% dos embriões chegaram ao estádio de blastocisto, enquanto que no grupo NTSCi suíno não houve desenvolvimento até o estádio de blastocisto. Na terceira parte do trabalho, experimentos visando a utilização de oócitos vitrificados imaturos, com citoplasma receptor, foram realizados. Foram submetidos à maturação 764 complexos cumuli-oócitos vitrificados, e 73% destes foram recuperados após o desnudamento, e 46,8% apresentavam corpúsculo polar, taxas significativamente inferiores às observadas nos oócitos não-vitrificados (91,4% e 65,8%, respectivamente). As taxas de sobrevivência após a micromanipulação (77,8%), taxa de fusão (82,1%) e de sobrevivência após a ativação (79,9%) do grupo vitrificado, não apresentaram diferença significativa com o grupo controle não-vitrificado. As taxas de blastocistos também não apresentaram diferença entre os grupos vitrificado e não-vitrificado (16,7% e 23,4%), respectivamente. Em resumo, os resultados deste trabalho demonstraram que oócitos bovinos frescos ou vitrificados, nas nossas condições estabelecidas, foram capazes de suportar o desenvolvimento de embriões clones bovinos até o estádio de blastocisto ou a termo, e proporcionaram citoplasmas compatíveis para o desenvolvimento de embriões clones interespécie até o estádio de blastócito.